BCA法的原理

　　BCA法又被稱為Smith法，是由Pierce公司的Paul K. Smith等人在1985年對Lowry法進行改進，提出用BCA代替Folin-酚試劑而建立的(Smith, P.K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Anal Biochem.1985,150:76-85.)。

　　該方法的原理是，在堿性條件下，蛋白質中的肽鍵與Cu2+絡合，同時將Cu2+還原為Cu+，BCA螯合Cu+形成紫色絡合物，測定562 nm 的 OD 值來計算蛋白質濃度。

BCA究竟是怎么與蛋白質反應的？

　　要回答這個這個問題，首先需要了解BCA法涉及的兩個反應步驟：首先是雙縮脲反應，在堿性條件下，蛋白質中的肽鍵與Cu2+絡合，同時將Cu2+還原為Cu+;接下來，2個BCA分子螯合1個Cu+，形成紫色絡合物。

那雙縮脲反應是如何進行的？又是如何將

雙縮脲反應原理:

　　首先，脲就是尿素，兩分子尿素在一定的條件下(180℃左右加熱)，生成一個分子氨(NH3)縮合得到雙縮脲。正是因為該物質是由兩分子脲縮合而成的，故名雙縮脲。

　　雙縮脲在堿性溶液中能與極稀的硫酸銅溶液形成紫色絡合物，這個呈色反應叫做雙縮脲反應。

　　雙縮脲試劑最初是指能夠提供堿性條件和銅離子、用以鑒定或檢測雙縮脲存在的試劑。由于蛋白質分子中含有很多與雙縮脲結構相似的肽鍵，因此也能與銅離子在堿性溶液中發(fā)生雙縮脲反應，且顏色深淺與蛋白質的含量的關系在一定范圍內符合比爾定律，而與蛋白質的氨基酸組成及分子量無關，故可用雙縮脲法測定蛋白質的含量。

那為什么肽鍵能與銅離子形成紫色絡合物呢？

　　絡合物又稱配位化合物。凡是由兩個或兩個以上含有孤對電子(或π鍵)的分子或離子作配位體，與具有空的價電子軌道的中心原子或離子結合而成的結構單元稱絡合單元。

　　銅的外層電子組態(tài)是3d104s1，一般的銅會失去兩個電子，其外層電子組態(tài)是3d9。九個電子占據5個d軌道，必然還會有一個軌道上是單電子。所以銅離子容易與肽鍵上帶有孤對電子的氮形成絡合物。但由于Cu2+為d9構型，使得姜-泰勒效應較為顯著，會發(fā)生晶體場形變(拉長)，四邊形平面上連接氮的四個鍵較短，而H2O的兩個鍵較長。

那為什么雙縮脲反應要在堿性條件下？

　　蛋白質雙縮脲反應實質是肽鍵絡合Cu2+，肽鍵是酰胺鍵的一種，其pKa大約為-0.5，當pH=-0.5時，有50%酰胺質子化，當pH-pKa>2時，幾乎所有酰胺都去質子化。在強堿(pH 11.25)條件，可以促使肽鍵中N上的H+部分電離，電子云密度增大，易于和Cu2+配位，形成紫色螯合物。

那雙縮脲反應又是如何將Cu

　　生物化學定義，肽鍵是氨基酸分子間的氨基和羧基脫水縮合而形成的化學鍵，因縮合產物稱為肽，故名肽鍵。其中氮原子上的孤對電子能與氧原子形成配位共價結合而具有還原性，但是C-N鍵中氮原子上的孤對電子與相鄰羰基上的π電子共同組成三中心四電子的離域π鍵(π34)，分散了氮原子上的孤對電子;再加上羰基氧原子吸電子作用也使氮上電子云密度降低，導致氮原子結合氧原子能力減弱，具有弱還原性。

　　但是在強堿(pH 11.25)條件，可以促使肽鍵中N上的H+部分電離，電子云密度增大，使得氮原子結合氧原子能力增加，還原性增加，可以將Cu2+還原成Cu+。

　　同時，由于蛋白質肽鍵-Cu2+絡合，使得肽鏈展開，蛋白質中色氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、胱氨酸等還原性氨基酸殘基充分暴露，也可以將Cu2+還原成Cu+。

那接下來，BCA又是如何螯合Cu

　　當Cu2+被蛋白還原成Cu+，Cu+與蛋白質肽鍵的絡合能力變弱，此時BCA競爭性、特異性地絡合Cu+，形成穩(wěn)定的紫色絡合物。

　　此步驟還涉及三個問題：1. BCA為什么不與Cu2+絡合;2. 為什么肽鍵能與Cu2+穩(wěn)定絡合，而與Cu+的絡合能力減弱;3. BCA是如何與Cu+絡合的。

　　可能的原因：Cu+的價電子為3d10，處于全滿狀態(tài)，在非極性環(huán)境穩(wěn)定，而在水中容易發(fā)生歧化反應生成Cu2+。Cu2+的價電子雖然為3d9，但是在極性水溶液環(huán)境中，由于其水合能遠高于Cu+，反而更穩(wěn)定。一是Cu2+電荷更高，半徑更小;二是由于Cu2+的d9結構，在水分子的配位場作用下，發(fā)生d軌道能級分裂，得到了配位場穩(wěn)定化能和姜-泰勒畸變穩(wěn)定化能，在水中變得更穩(wěn)定。

　　所以，Cu2+在緩沖液中不與BCA絡合，因為BCA帶有疏水芳香環(huán)，而更容易與蛋白質肽鍵和水分子絡合;當Cu2+被還原成Cu+，其與肽鍵的絡合作用減弱，反而與BCA形成穩(wěn)定絡合物，也是因為BCA提供了疏水芳香環(huán)，再加上芳香環(huán)的剛性穩(wěn)定性和離域π電子共軛體系，形成的絡合物更穩(wěn)定。`這也是BCA為什么可以和Cu2+混合在一起與蛋白質樣品反應的原因，一是BCA不與Cu2+，配制在一起簡化操作;二是Cu2+被還原成Cu+，BCA便可以快速與其形成穩(wěn)定紫色絡合物。

　　以上便是BCA測定蛋白質含量的化學生物學原理，結合了絡合物化學，肽鍵化學，有機還原反應，Cu2+和Cu+絡合物區(qū)別等相關化學生物學知識。

題外：

　　1.1893年，瑞士化學家維爾納總結了前人的理論，首次提出了現(xiàn)代的配位鍵、配位數(shù)和配位化合物結構等一系列基本概念，成功解釋了很多配合物的電導性質、異構現(xiàn)象及磁性。自此，配位化學才有了本質上的發(fā)展。維爾納也被稱為“配位化學之父”，并因此獲得了1913年的諾貝爾化學獎。

　　2.BCA法有著高度的均一性，相對于Bradford染料結合方法而言，不同蛋白質之間的變異性更小。原因是，Bradford法主要是染料與蛋白質堿性氨基酸和芳香族氨基酸殘基結合，不同蛋白質含有上述氨基酸殘基量不同，導致變異性增加;而BCA法除了蛋白質中還原性氨基酸殘基參與Cu2+還原成Cu+外(受到蛋白氨基酸序列中四個氨基酸殘基(半胱氨酸、胱氨酸、酪氨酸和色氨酸)含量不同的影響)，蛋白質中無差別的肽鍵也參與還原過程，有報道稱蛋白質肽鍵絡合Cu2+，并將其還原成Cu+的比例占到75%，起主要作用，那蛋白質相互間的差異至少降低到25%以下，這也是BCA測量蛋白時候比Bradford法線性更好，測量準確性更高的原因。

　　3.盡管在BCA法中蛋白、銅離子和BCA之間的互相作用機制尚未得到清楚的闡述，但并不妨礙此方法在蛋白濃度測定中的廣泛應用，據統(tǒng)計，此方法在Google學術的引用率超過14萬次，是近年來蛋白濃度測定最常用的方法之一。

　　這也許就是實驗科學，很多時候都是先觀察得到現(xiàn)象與結果，然后再用一系列假說和原理試圖去解釋闡述。BCA方法從1985年發(fā)明至今已經37年，其涉及的作用機制依然未解釋清楚。